UNIVERSITY OF SCIENCE

Campus 1: 227 Nguyen Van Cu Street, Ward 4, District 5, Ho Chi Minh City

Campus 2: Linh Trung, Thu Duc District, Ho Chi Minh City

Tiếng ViệtEnglish

Quy trình dòng hoá “RFC” (Recombinase-free cloning)

10:09, 31/03/2022
599
0
Dòng hóa DNA (DNA cloning), một trong những kỹ thuật nghiên cứu cơ bản về sinh học phân tử và là công cụ hiệu quả nhằm cung cấp những hiểu biết về gen và những phân tử liên quan. Kỹ thuật dòng hóa dựa trên enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme cloning – REC) được xem là phương pháp truyền thống và được sử dụng phổ biến. 

Những enzyme cắt giới hạn đóng vai trò “cây kéo”, giúp xử lý các phần DNA để tạo đầu tương hợp, trong khi đó, enzyme nối đóng vai trò “chất keo” gắn kết những phần DNA, tạo nên vector tái tổ hợp. Hai chức năng trái ngược này bổ trợ cho nhau, hình thành nền tảng kỹ thuật bền vững cho nghiên cứu phân tử. Tuy nhiên, điều này đồng nghĩa với việc REC phụ thuộc rất nhiều vào hoạt tính enzyme, và hiệu suất dòng hóa sẽ giảm khi một trong những nhân tố của REC hoạt động không hiệu quả. Enzyme cắt giới hạn và enzyme nối cần có dung dịch đệm riêng để đảm bảo hoạt tính, trong khi đệm dành cho enzyme cắt giới hạn rất ổn định, thì đệm dành cho enzyme nối lại chứa ATP, một chất không bền và sự giảm nồng độ của ATP làm hiệu suất nối giảm đáng kể. Phần lớn các enzyme nối, đặc biệt là T4 ligase – loại enzyme sử dụng phổ biến trong REC, là enzyme phụ thuộc ATP – thành phần quan trọng cho sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 và 3’-OH. Do đó, đệm dành cho enzyme nối cần được bảo quản trong điều kiện âm sâu và hạn chế sự giải đông nhiều lần, dẫn đến làm tăng chi phí cũng như mang lại nhiều bất tiện trong việc sử dụng ở những phòng thí nghiệm không đủ điều kiện. Điều đó tạo ra nhược điểm lớn cho công cụ vốn được xem là đắc lực này. Enzyme nối vẫn luôn giữ vai trò quan trọng suốt bao lâu nay, vậy điều gì sẽ xảy ra khi công cụ này hoàn toàn bị loại bỏ trong quy trình dòng hóa? Nhiều nỗ lực đã được tiến hành để trả lời cho câu hỏi đó, với sự ra đời của nhiều kỹ thuật mới: MCT cloning, Restriction-free cloning, Ligation-independent cloning, SLiCE, …. Tuy nhiên, các kỹ thuật này lại có những hạn chế khác, như cần có enzyme mắc tiền, quy trình phức tạp đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí, ….
Với nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu một kỹ thuật dòng hóa cải tiến, đơn giản và tiết kiệm hơn, Recombinase-free cloning – RFC. Kỹ thuật này chỉ cần một phản ứng PCR thu gen, cùng với một phản ứng xử lý plasmid bằng enzyme cắt giới hạn, và không cần sự hỗ trợ của bất kỳ enzyme đắt tiền nào khác. RFC được sử dụng khi gen mục tiêu chứa trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn, hoặc khi cần tạo những trình tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn mới, đồng thời xây dựng chiến lược dòng hóa không phụ thuộc enzyme nối. Kỹ thuật này sử dụng hệ thống recombinase nội bào từ chính vi khuẩn E. coli để tạo ra vector tái tổ hợp bên trong tế bào. Bằng cách thiết kế mồi thu gen có chèn thêm đoạn trình tự tương đồng với vùng trình tự trên plasmid, khi cho gen và plasmid đã cắt tương tác với nhau ở nhiệt độ thích hợp, trên vùng trình tự tương đồng sẽ hình thành những liên kết hydro, tạm thời gắn kết gen mục tiêu và plasmid. Khi sản phẩm này được đưa vào tế bào E. coli, những vùng liên kết tạm thời sẽ được enzyme recombinase sửa chữa, giúp hình thành vector tái tổ hợp hoàn chỉnh. Bên cạnh đó, những bước tinh sạch cơ bản cũng được lược bỏ nhằm tiết kiệm thời gian, hóa chất, và giảm sự hao hụt các thành phần DNA. Một chiến lược dòng hóa sử dụng RFC có thể được hoàn thành trong vòng 9 tiếng, giúp tiết kiệm rất nhiều thời gian so với REC truyền thống. Quy trình đã được áp dụng trên một dải kích thước gen mục tiêu từ 500-1000 bp, với khả năng dòng hóa gần như tuyệt đối dù hiệu suất tương đối thấp. Tóm lại, dù còn một số điểm cần được cải thiện, RFC vẫn là kỹ thuật tiềm năng, có thể áp dụng được ở cả những phòng thí nghiệm có ít trang bị.
Thông tin chi tiết hơn về kết quả nghiên cứu của công trình được mô tả trong bài báo sau: Hai-Vy Vo-Nguyen, Thanh-Tan Nguyen, Quoc-Gia Mai, Thien-Thien Tran, Thuoc Linh Tran, Hieu Tran-Van. Recombinase-free cloning (RFC) protocol for gene swapping. Molecular Biology Research Communications, 2022; 11(1):21-27. doi: 10.22099/MBRC.2021.41923.1685
Link công bố: https://mbrc.shirazu.ac.ir/article_6552.html 

RFC

Người viết : admin
  • (028) 38 355 273
  • (028) 38 355 273
  • (028) 38 355 273